1. 目的
本程序是為了建立谷氨酸脫氫酶(Glutamate Dehydrogenase)的活性檢測(cè)方法,適用于GLDH成品的活性檢測(cè)。
2. 范圍
適用于GLDH成品、半成品及其他樣品的檢測(cè)。
4. 定義
U: 在pH7.3, 37度的環(huán)境下, 每分鐘轉(zhuǎn)化1umolα-酮戊二酸變成L-谷氨酸所需要的酶量。
活性: 每毫升樣品中的活性值。
比活: 每毫克蛋白的活性值。
5. 內(nèi)容
5.1原理
α-Ketoglutarate + NH3 + NADH + H+ L-Glutamate+ NAD+ +H2O
NADH的消耗可以通過340nm的光吸收進(jìn)行檢測(cè)。
5.2試劑:
A 0.1 M Tris-HCl 緩沖液, pH 8.3
B 1.5M NH4Cl溶液
C 0.225M α-酮戊二酸溶液(pH 7.0-9.0)
D 7.5mM NADH溶液
E 酶稀釋液: 0.1 M Tris-HCl 緩沖液, pH 8.3
試劑的配制方法詳見各試劑配制記錄,配制人員需完整填寫配制記錄。
5.3 操作規(guī)程:
5.3.1儀器參數(shù)設(shè)定
若儀器中無已保存參數(shù),按以下參數(shù)設(shè)定。若已有相關(guān)參數(shù),調(diào)取后確認(rèn)。
檢測(cè)方法:動(dòng)力學(xué)掃描
測(cè)量波長(zhǎng):340nm 測(cè)量時(shí)間:180s
延遲時(shí)間:60s 積分時(shí)間:120s
系數(shù)/因子:6.776 測(cè)量溫度:30±1℃
5.3.2 樣品準(zhǔn)備
若待測(cè)樣品為固體,可以按10mg 樣品/1000ul 超純水比例溶解。溶解后于2-8度放置30min。
5.3.3 檢測(cè)方法
5.3.3.1 在石英比色皿中加入2.5ml 試劑A, 200ul試劑B,100ul 試劑C, 100ul D于30度孵育2min。
5.3.3.2 加入50ul 樣品后, 溫和混勻后開始測(cè)定。
5.3.3.3 測(cè)定結(jié)束后,記錄相應(yīng)數(shù)值:起始讀數(shù)、△A/min test、活性值(U/ml)。
5.3.3.4 活性值(U/ml)范圍為0.1-0.3U/ml,若超出范圍,待測(cè)樣品需經(jīng)試劑D稀釋后再次進(jìn)行檢測(cè)。
5.3.3.5測(cè)定樣品前需檢測(cè)空白反應(yīng)值,即其他操作不變,用500ul E代替樣品加入比色皿后進(jìn)行反應(yīng),測(cè)定△A/min blank。
5.3.3.6計(jì)算公式 活性(U/ml) =(△A/min test-△A/min blank)×6.776×df (稀釋倍數(shù))
5.4 成品檢測(cè)結(jié)果精密度要求:每個(gè)樣品檢測(cè)時(shí),在線性范圍內(nèi)選擇三個(gè)不同的稀釋度進(jìn)行測(cè)定,得到的原液/粉末活性,計(jì)算Cv值,Cv值得要求為<5%,達(dá)到要求后,此次測(cè)定的結(jié)果認(rèn)為有效, 取三個(gè)檢測(cè)數(shù)值的平均數(shù)作為最終的檢測(cè)數(shù)值。若不能達(dá)到,對(duì)此三個(gè)稀釋應(yīng)進(jìn)行重新檢測(cè)。
此方法僅作為參考!
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